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Index & Contents

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`예비 레포트`

1. 실험 목적

Bradford Assay를 사용하여 이미 정량된 특정 단백질을 정량하고, 이를 통해 미지의 단백질을 정량한다.

 

2. 실험 원리

단백질이 당질이나 지질과 다른 점은 탄소, 수소 그리고 산소 이외에도 반드시 질소를 함유하고 있는 특징을 가지고 있는 물질들을 말한다. 또한 단백질이란 동식물체의 가장 중요한 구성 성분들의 하나인 동시에 동식물들이 생체로서의 기능을 수행하는데 있어서도 여러 가지 중요한 역할을 맡고 있는 물질들의 주요 구성 성분들로서 화학적으로 수많은 여러 종류의 아미노산들이 펩타이드 결합을 통해서 결합된 고분자 화합물들이라고 할 수 있다.

 

▶Bradford Assay

1) 특징 : Biuret method와 Lowry method의 단점을 보완한 단백질의 정량법

2) 원리 : 염색약인 Coomassie brilliant blue dye가 단백질과 결합하게 되면 최대 흡광 파장이 465nm에서 595nm로 바뀌게 되는 성질을 이용하여 595nm에서의 흡광량이 단백질의 농도를 나타내게 되는 방법이다. Coomassie brilliant blueG250, phosphoric acid, methanol의 혼합물로 시판되는 Bradford solution이 assay법에서 요구되는 유일한 reagent이며 단백질과Bradford solution의 반응은 2분 안에 완결되고 발색정도는 1시간까지 안정하게 유지된다.

3)장점 :

- 방법이 간단하다.

- 반응이 신속하게 진행된다.

- 감도가 높아서 1μg까지도 정량 가능하다.

- 환원제와 EDTA의 영향을 거의 받지 않는다.

4) 단점 :

- 계면활성제의 영향을 받기 쉽다.

- 반응액이 산성이기 때문에 지질을 대량으로 함유하는 sample에서는 침전을 생성하는 경우가 있다.

- 희석시키면 농도가 떨어져서 다시 실험 할 때 어려움이 있다.

- 사용한 단백질은 비가역적으로 변성된다.

 

3. 실험기구 및 시약

Bradford Solution : Coomassie brilliant blueG250, phosphoric acid, methanol의 혼합물

BSA(bovine serum albumin) : 혈장 내에 다량 함유되어 있는 단백질로서 총단백질의 약 60%를 차지하고 있음

증류수

1.5mL tube

vortex mixer

rack

tip

96 well plate

spectrophotometer

micropopet

 

4. 실험방법

BSA standard 만들기 : 1.5mL tube에 1mg/mL의 BSA와 증류수를 혼합하여 standard를 만든다.(정확도를 위해 두 set씩 만든다.)

(단위 : μL)

 

BSA standard

BSA

0

…(생략)

 

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