western blotting 레포트
[목차]
1. Introduction
2. Material & Methods
3. Results
4. Discussion
5. Reference
4. Discussion
⇒ 위의 실험결과를 보면, 1조에서는 Epithin을 blot 했는데 우리가 실험 전에 예상했던 92kDa과 110kDa 의 두 가지 밴드가 나타나지 않았고 110kDa의 밴드만이 나타난 것을 볼 수 있었다. Epithin이 transfection되지 않은 cell extract에서는 관찰할 수 없었고, 4㎍이 2㎍보다 더 굵은 밴드를 나타내어 그 상대적인 양을 나타내어 주는 것을 알 수 있었다.
primary antibody를 처리하지 않고, secondary antibody 만 처리해본 2조의 결과는 예상대로 아무 밴드가 나타나지 않았다. 우리 조, 3조의 실험결과도 예상대로 모든 cell extracts에서 tubulin 단백질이 있었기 때문에 50kDa에 모두 밴드가 나타났다. blocking을 하지 않은 4조의 실험결과도 예상대로 여러 단백질 밴드를 관찰할 수 있었다. 또한 Epithin antibody를 사용했기 때문에 92kDa, 110kDa부분에서 조금 짙고 굵은 밴드가 나타나는 것을 볼 수 있었다.
그러면 왜 1조의 실험결과에서 92kDa의 Epi-S 밴드가 나타나지 않은 걸까?
epithin 단백질은 실험대상 mouse에게 transfection되어 항원-항체 반응을 일으키는 항원이 된다. 처음 transfection되면 mouse의 cell속의 핵으로 들어가서 존재하고 있다가 발현되면서 핵에서 소포제(ER)로 전달되고(이때, 110kDa) 필요에 따라 processing되어 membrane밖으로 나오게 되는데, 그 과정에서 92kDa의 크기로 작아지게 되는 것이다. 1조의 실험결과를 보고 역으로 추측해 본다면, 실험결과로 관찰된 epithin 단백질은 cell의 ER에 존재하는 형태로 아직 processing과정을 거치지 않았거나 아주 미량만이 92KDa의 크기로 존재하고 있어 실험결과로는 관찰이 되지 않았을 것이라는 생각을 해볼 수 있다.
또 다른 가능성은 shaking이 원활히 되지 않은 경우를 고려해 볼 수 있는데, 거의 대부분의 과정에서 우리가 직접 손으로 shaking 하였기 때문에 이과정이 제대로 되지 않아서 혹은 너무 심하게 흔들어져서 1차 항체가 항원에 결합되지 못했거나 2차 항체가 1차 항체와 결합되지 못했을 수도 있었을 것이다. 하지만 110kDa Epi-L의 밴드는 확실히 나타났으므로 이런 가능성은 조금 미약하다 할 수 있고, 확실치는 않지만 processing되면서 Epithin의 크기가 작아졌기 때문에 항체와의 affinity도 상대적으로 줄…(생략)
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